减少内毒素合规检测中鲎试剂的使用

近年来，在质量控制检测方面，制药技术有了重大改进和进步。其中一项检测是鲎试剂检测水和zui终药品中的细菌内毒素，内毒素是一种有害的热原。传统的光度法鲎试剂检测——包括用于动态浊度法和动态显色法的96孔板检测——耗时且需要大量手动时间。现在，通过使用微流控技术，可以显著减少液体处理和手动时间，同时减少鲎试剂和样品量，并且保证合规性。

合规化验需要多少鲎试剂？

传统的鲎试剂检测使用96孔板，每个孔具有特定的形状和吸光度的路径长度。96孔板的路径长度根据制造商或厂商略有不同。这是因为平底96孔板上的孔通常是截头圆锥体，便于从模具中脱模。¹

由于孔的深度和形状，鲎试剂制造商规定了每个孔需要多少样品量和鲎试剂，以保持内毒素检测的1:1比例。动力学内毒素测定依赖于光密度（OD）变化和内毒素浓度之间的反比关系。OD是“用分光光度计测定的有机分子悬浮液或溶液在特定波长下吸收的光量”。²

样品与鲎试剂的比例（1:1）非常重要。大多数鲎试剂制造商建议96孔板读数器和试管读取器使用100 µL样品至100 µL鲎试剂。有些鲎试剂使用的样品和鲎试剂少于100 µL，这些鲎试剂通常在具有较小孔的微孔板中运行。然而，1:1的比例仍然保持不变。多年来，已证明这种1:1的比例可以准确地得出内毒素结果。使用100 µL的样品和鲎试剂不是法规或药典的要求。相反，它是根据孔板或试管读取器的孔径大小、所需的路径长度和达到光密度的吸光度，给出使用多少体积（样品和鲎试剂）才能达到1:1比例的一项建议。

微流控技术可以使用更小的反应体积

进行准确、可靠和合规的内毒素检测

近年来，鲎试剂检测出现了新的创新，如Sievers® Eclipse细菌内毒素检测仪。Eclipse利用微流控技术和向心力将小体积的液体准确地输送到微孔板上的特定部分，从而大大减少了所需的试剂量并简化了设置。30多年来，微流控一直是一个蓬勃发展的研究领域，因为它能够满足准确、经济高效、可靠和灵敏的化学和生物分析需求，而这正是内毒素分析所需要的。

向心微流控用于鲎试剂测试

Eclipse微孔板在五个区域中嵌入了不同浓度的标准品可制成标准曲线，每个浓度的标准品都有阴性对照。有21个样品区用户可以在一个板上运行多达21个样品，类似于96孔板读取器。每个样品区都含有阳性产品对照的内毒素。

由于微流体需要较小的反应体积，但不会改变生物化学结构和特性，因此，将Eclipse微流控技术设计为使用比典型方法更少的鲎试剂，同时保证完全合规性。Eclipse的光密度是用比尔定律计算出来的。比尔定律，也称为比尔-朗伯定律，指出“化学溶液的浓度与其对光的吸收成正比。”³由于微流体的性质，包括流体通道和样品/鲎试剂室，Eclipse只需要1 mL鲎试剂，并确保每次测定的样品与鲎试剂比例为1:1。

确保Sievers Eclipse的性能

与传统的微孔板读取器相当

在Eclipse的整个开发过程中进行了广泛的测试，以确保与96孔板读取器的性能相当。《美国药典》在<1225>一章中概述了验证分析方法时需要考虑的参数。Eclipse的系统性能是通过测定USP <1225>中列出的不同参数来评估的。

多年来，Sievers分析仪对来自多家厂商的多个鲎试剂批次进行了测试。除了鲎试剂水外，我们还在Eclipse和96孔板读取器上运行了药品样品。数据显示，Eclipse的性能与传统的微孔板读取器相当。总结即为，Eclipse使用符合药典的动态显色鲎试剂进行合规的细菌内毒素检测。根据USP <1225>的验证数据表明，Eclipse相当于96孔板读取器。

原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2023年5-6月刊，本文有所修改。

参考文献

1. Sievers Analytical Instruments. Determining equivalent onset optical density (OD) values on the Sievers Eclipse BET platform.

2. McCullough, Karen Zink. The Bacterial Endotoxins Test: A Practical Approach. DHI Publishing, LLC, 2011.

3. Helmenstine, Anne Marie. Beer’s Law Definition and Equation. Thought Co, 2019. https:// www.thoughtco.com/beers-law-definition-and-equation-608172